La formazione del nucleo originario della Biblioteca si deve all'archeologo Dante Vaglieri, primo direttore degli Scavi di Ostia antica (1907-1913), che raccolse circa 400 tra monografie e riviste di ambito prevalentemente archeologico. Questi volumi costituiscono il Fondo Vaglieri, che include una nutrita raccolta di classici greci e latini, opere di epigrafia, numismatica e repertori ceramici, nonché preziose opere a stampa del Seicento e del Settecento. La raccolta di Vaglieri, nata per esigenze di lavoro e studio, alla morte dello studioso fu donata dalle figlie alla Direzione degli Scavi: nel corso degli anni è stata costantemente arricchita con donazioni e acquisti, fino a raggiungere gli attuali 10.000 volumi circa.

La Biblioteca è divisa in varie sezioni, tra le quali spicca quella relativa al Ostia e al territorio ostiense; al suo interno si strova l'importante collana degli Scavi di Ostia, dedicata alla topografia e all'urbanistica Ostiense. Oltre alla nutrita e aggiornata sezione dei Periodici, spicca per estensione la raccolta dei Cataloghi di mostre, prevalentemente di argomento archeologico.

Significativo è il settore dei lasciti di grandi studiosi ostiensi come Dante Vaglieri, Guido Calza, Raissa Gourevich Calza e Giovanni Becatti, che hanno dedicato la loro vita di studiosi ad Ostia, in particolare nel periodo dei grandi scavi dagli anni '30 del Novecento.

Nuova sezione Digit-Osti@
La Biblioteca Ostiense offre in consultazione libera e gratuita una parte delle collezioni del patrimonio bibliografico ostiense in formato pdf. La nuova digital library è articolata in tre sezioni: le pubblicazioni della ex-Soprintendenza, le MIscellanee Ostiensi, la Miscellanea Raissa Calza.
La sezione "pubblicazioni dell'ex-Soprintendenza" raccoglie le opere divulgative a stampa prodotte dalla soppressa Soprintendenza archeologica di Ostia, precedente denominazione del Parco archeologico di Ostia antica. Nella sezione "Miscellanee Ostiensi" si trovano contributi di vari autori dalla metà dell'Ottocento fino a oggi su Ostia e Porto, nonché volumi di grande importanza per la storia degli studi ostiensi, come "Ostia colonia romana" di Ludovico Paschetto. Infine, la sezione "Miscellanea Raissa Calza" raccoglie gli scritti dell'archeologa e storica dell'arte attiva per più di trent'anni negli scavi di Ostia.